ヌクレオチドチオリン酸塩を利用した大腸菌DNAジラーゼのメカニズムの解明

Exploiting nucleotide thiophosphates to probe mechanistic aspects of Escherichia coli DNA gyrase.

• P M Cullis
• A Maxwell
• D P Weiner

抄録

ATPとDNAジラーゼの相互作用は、チオリン酸ATPアナログの範囲を使用してプローブされています。ATPγSは、ジラーゼによって検出可能な加水分解されていませんが、おそらく触媒的に、限られた、DNAスーパーコイルをサポートすることができます。ATPγSは、ATP加水分解とATPサポートスーパーコイルの両方の良い阻害剤です。対照的に、ＡＴＰαＳ（Ｒｐ）およびＡＴＰβＳ（Ｒｐ）の両方が、ジラーゼのＡＴＰラーゼ反応のための良好な基質であり、触媒的なＤＮＡスーパーコイリングを支持することが示されている。対応するSpのジアステレオ異性体は、有意なレベルのスーパーコイルをサポートしておらず、容易に加水分解されませんが、ジラーゼの合理的な阻害剤であることが示されています。ATPαS(Rp)については、スーパーコイルとATPアーゼ活性は、DNAスーパーコイルとヌクレオチド加水分解の両方の面でATPよりも明らかに優れた基質であるチオヌクレオチドと密接に結合しているように見える。ATP βS（Rp）の場合には、DNAスーパーコイルとヌクレオチド加水分解は、ATP βS（Rp）は、それが唯一の遅いDNAスーパーコイルをサポートしているのに対し、無傷のジラーゼと43 kDaのGyrBフラグメントの両方のATPの反応のためのATPとしてほぼ同じくらい良い基質であることでアンカップリングされているように見える;これらの観察の機構的な結果は、ジラーゼのエネルギーカップリングのための新しいモデルの観点から議論されています。DNAジラーゼは、Mg2+, Ca2+, Mn2+の存在下ではDNAスーパーコイル化を触媒することができるが、Zn2+, Co2+, Ni2+, Cd2+の存在下では触媒しないことが示されている。43 kDaのGyrB-ADPNP-Mg複合体のX線構造からの証拠と一緒にATP alphaSとATP betaSを持つDNAスーパーコイルとATPアーゼ活性の両方で見られる顕著なジアステレオ選択性は、これらのサイトの両方で、おそらくターンオーバー中にガンマリン酸化中心に金属イオンの配位と一致しています。したがって、触媒的に活性なMg2+-ATP複合体の絶対配置は、PαとPβの両方でプロ-S酸素に配位している可能性が高く、λ-エキソ配置のα,β,γ-三座配位型Mg-ATP複合体につながると考えられる。

The interaction of DNA gyrase with ATP has been probed using a range of thiophosphate ATP analogs. ATP gammaS is not detectably hydrolyzed by gyrase but can support limited, probably catalytic, DNA supercoiling. ATP gammaS is a good inhibitor of both ATP hydrolysis and ATP-supported supercoiling. In contrast, both ATP alphaS(Rp) and ATP betaS(Rp) have been shown to be good substrates for the ATPase reaction of gyrase and to support catalytic DNA supercoiling. The corresponding Sp diastereoisomers do not support significant levels of supercoiling and are not readily hydrolyzed, but are shown to be reasonable inhibitors of gyrase. For ATP alphaS(Rp), the supercoiling and ATPase activities appear to be tightly coupled with the thionucleotide being apparently a better substrate than ATP in terms of both DNA supercoiling and nucleotide hydrolysis. In the case of ATP betaS(Rp), DNA supercoiling and nucleotide hydrolysis appear to be uncoupled in that ATP betaS(Rp) is almost as good a substrate as ATP for the ATPase reaction of both intact gyrase and the 43 kDa GyrB fragment, whereas it only supports slow DNA supercoiling; the mechanistic consequences of these observations are discussed in terms of a new model for energy coupling in gyrase. DNA gyrase has been shown to be capable of catalyzing DNA supercoiling in the presence of Mg2+, Ca2+, and Mn2+ but not Zn2+, Co2+, Ni2+, or Cd2+. The pronounced diastereoselectivity seen in both the DNA supercoiling and ATPase activity with ATP alphaS and ATP betaS together with evidence from the X-ray structure of the 43 kDa GyrB-ADPNP-Mg complex is consistent with metal ion coordination at both of these sites, and probably to the gamma-phosphoryl center during turnover. Thus, the absolute configuration of the catalytically active Mg2+-ATP complex is likely to involve coordination to the pro-S oxygens at both P alpha and P beta, leading to the alpha,beta,gamma-tridentate Mg-ATP complex with the lambda-exo configuration.